Родилась в семье Никиты Михалкова и Татьяны Михалковой.
Отец снял художественно-публицистический фильм «Анна: от 6 до 18», в котором ей в течение 12 лет задаются одни и те же вопросы, ответы монтируются с хроникой тех лет.
После окончания школы два года училась истории искусств (год в Швейцарии и год в Италии). Актёрское образование получила во ВГИКе, на курсе Анатолия Ромашина. Окончив ВГИК, поступила на юридический факультет МГИМО.
Дебютом в кино стала эпизодическая роль девочки в фильме своего отца «Очи чёрные», снятого по сюжетным мотивам рассказов А. П. Чехова. Затем последовала роль Зинаиды роль в экранизации повести «Первая любовь» И. С. Тургенева режиссёра Романа Балаяна, роль Марьи Антоновны в экранизации комедии Н. В. Гоголя «Ревизор» режиссёра Сергея Газарова и роли в фильмах «Небо в алмазах» режиссёра Василия Пичула и «Сибирский цирюльник» Никиты Михалкова. В 2003 году сыграла злодейку Анну в сериале по повести Л. А. Чарской «Сибирочка» режиссёра Владимира Грамматикова. В 2006 году за роль милиционера Люды в фильме Кирилла Серебренникова «Изображая жертву» была отмечена премией кинокритиков и номинирована на премию «Ника».
Знаковой стала роль Катерины в картине о Великой Отечественной войне «Свои» режиссёра Дмитрия Месхиева:
Большое количество наград актрисе принесло сотворчество с режиссёром Авдотьей Смирновой. Первая их совместная работа — мелодрама «Связь», фильм о любви замужней женщины и женатого мужчины, которые так и не решились соединить свои судьбы. За исполнение этой роли актриса получила премию «Золотой орёл». Затем последовал фильм «Кококо», сценарий которого был написан Анной Пармас специально под Анну Михалкову.
В 2017 году актриса исполнила одну из главных ролей в медицинском детективе «Доктор Рихтер», официальной адаптации американского сериала «Доктор Хаус». Елизавета Никольская, главный врач и главная сдерживающая сила доктора Рихтера, получилась совсем не похожей на персонажа из американского сериала. Режиссёр Андрей Прошкин прокомментировал выбор её кандидатуры:
Анна Михалкова активно снимается в кино и параллельно с этим пробует себя в качестве продюсера. Первым самостоятельным проектом стал социальный триллер Леонида Рыбакова «Скажи Лео» о реальном и виртуальном мире. В 2009 году с режиссёром Игорем Волошиным Михалкова выпустила боевик «Я». Позже вышла мелодрама Алисы Хмельницкой и Резо Гигинеишвили «Без мужчин», где одну из главных ролей исполнила её сестра Надежда. В 2014 году выпустила детский комедийный фильм «Федька» в сотворчестве с Любовью Андреевой.
С марта 2002 года ведёт детскую передачу «Спокойной ночи, малыши».
В 2003 году стала одним из создателей и продюсером кинооператорской премии «Белый квадрат», которая вручается ежегодно гильдией кинооператоров России за лучшую операторскую работу в полнометражных художественных фильмах.