Родился 9 мая 1981 года в Макеевке Донецкой области Украинской ССР. Детство и юность провёл на родине.
В 1998 году окончил Макеевский лицей № 1 (до 1992 года — средняя общеобразовательная школа № 14 Макеевки).
Учился в Донбасской национальной академии строительства и архитектуры (факультет «экономика предприятия»), но не окончил.
5 апреля 2014 года стал заместителем так называемого «народного губернатора» Донецкой области Павла Губарева, а затем возглавил митинг жителей Донецка. 7 апреля была провозглашена ДНР, Пушилин стал сопредседателем временного правительства ДНР.
15 мая 2014 года стал председателем президиума Верховного Совета ДНР (на тот момент высшая должность в ДНР согласно Конституции).
18 июля 2014 года Пушилин ушёл в отставку: находясь в Москве, он отправил письмо с просьбой об уходе с занимаемой должности по собственному желанию вице-спикеру парламента Владимиру Маковичу. После отставки являлся координатором и сопредседателем «Народного фронта Новороссии».
В сентябре 2014 года объявил, что собирается участвовать в ноябрьских выборах главы и депутатов Верховного Совета ДНР. В октябре зарегистрировался как кандидат в депутаты Верховного Совета ДНР от общественного движения «Донецкая республика».
По итогам всеобщих выборов в ДНР 3 ноября 2014 года стал депутатом Народного Совета ДНР от общественно-политического движения «Донецкая республика». 14 ноября 2014 года избран заместителем председателя Народного Совета.
9 ноября 2014 года Пушилин Указом Главы ДНР Александра Захарченко также назначен на должность Постоянного полномочного представителя республики на переговорах трёхсторонней контактной группы в Минске.
4 сентября 2015 года в ходе внеочередного заседания Народного Совета ДНР было принято решение о назначении Пушилина исполняющим обязанности председателя представительного органа республики. Сам Пушилин объяснил это тем, что предыдущий спикер Народного Совета Андрей Пургин отправлен в отставку из-за попытки срыва заседания. Также он заявил, что остаётся представителем ДНР на переговорах в Минске.
11 сентября 2015 года был избран председателем Народного Совета ДНР, за избрание проголосовали 76 депутатов.
7 сентября 2018 года назначен Народным Советом ДНР временно исполняющим обязанности главы ДНР до избрания Главы республики на всенародных выборах, назначенных на 11 ноября 2018 года. В тот же день Денис Пушилин отправил Совет Министров ДНР в отставку и провёл серьёзные кадровые изменения в исполнительной власти.
21 сентября 2018 года подал документы для участия в выборах главы ДНР 11 ноября 2018 года. По результатам голосования Денис Пушилин набрал 60,85 % голосов.
В декабре 2021 года Пушилин стал членом партии «Единая Россия»; 4 декабря на съезде партии Пушилину был вручён партийный билет.
21 февраля 2022 года Денис Пушилин подписал со стороны ДНР договор о дружбе, сотрудничестве и взаимной помощи с Россией.
30 сентября 2022 года Денис Пушилин подписал со стороны ДНР договор о вхождении республики в состав Российской Федерации.