Родился 25 февраля 1953 года в городе Николаевск-на-Амуре (Хабаровский край) в семье прокурорского работника. С шести лет жил в Краснодарском крае. Его отец был заместителем прокурора в Курганинском районе Краснодарского края.
1968—1972 — токарь на Кореновском сахарном заводе (Краснодарский край).
1972—1974 — срочная служба в рядах Советской армии.
В 1978 году окончил Харьковский юридический институт.
В 1978—1983 годы работал стажёром, помощником и старшим помощником прокурора Кореновского района Краснодарского края.
С 1983 года — заместитель прокурора Динского района, затем прокурор Гулькевичского района Краснодарского края.
С 1985 года — прокурор Хостинского района Сочи, с 1992 года — прокурор Сочи.
С 1994 года — первый заместитель прокурора Краснодарского края.
15 октября 1997 года назначен заместителем генерального прокурора РФ.
С июня 1998 года по апрель 1999 года — начальник главного управления Генпрокуратуры по надзору за исполнением законов о федеральной безопасности и межнациональным отношениям на Северном Кавказе, глава координационного совета правоохранительных органов субъектов Северо-Кавказского региона.
6 апреля 1999 года переведён в Москву.
29 июля 1999 года назначен и. о. генерального прокурора РФ.
17 мая 2000 года утверждён в должности Советом Федерации.
23 августа 2000 года — Устинов возглавил расследование гибели подводной лодки «Курск». Позднее он выпустил книгу «Правда о „Курске“» (ISBN 5-224-04862-1).
При Владимире Устинове Генпрокуратура сыграла исключительную роль в перераспределении собственности. Первым в июле 2000 года Россию покинул Владимир Гусинский. Тогда же активизировалось следствие в отношении Бориса Березовского, и в октябре 2000 года он уехал в Великобританию.
2001 — Устинов оказал успешное противодействие тогдашнему заместителю руководителя администрации президента РФ Дмитрию Козаку, который предложил лишить прокуратуру следственных функций, оставив ей только надзорные функции.
15 ноября 2001 года — лично возглавил группу государственных обвинителей в процессе над чеченским полевым командиром Салманом Радуевым. 25 декабря Радуев был приговорён к пожизненному заключению и уже через год умер в колонии.
В 2002 году в Московской государственной юридической академии (МГЮА) защитил кандидатскую диссертацию на тему «Международно-правовые проблемы борьбы с терроризмом». В 2003 (через год) защитил докторскую диссертацию.
В июне 2003 года с возбуждения уголовного дела по факту незаконной приватизации ОАО «Апатит» Генеральная прокуратура начала наступление на нефтяную компанию ЮКОС.
2 июля 2003 года был задержан руководитель МФО Менатеп Платон Лебедев, 25 октября — председатель правления ЮКОСа Михаил Ходорковский. В 2005 году оба были осуждены. Совладельцам ЮКОСа Леониду Невзлину, Владимиру Дубову и Михаилу Брудно удалось покинуть страну. ЮКОСу были предъявлены колоссальные налоговые претензии, что привело к утрате основного нефтедобывающего актива, банкротству и введению внешнего наблюдения. Деятельность генпрокуратуры, поддержанная президентом Владимиром Путиным, заставила остальных крупных бизнесменов стать лояльными к государству.
13 апреля 2005 года повторно утверждён в должности по представлению президента Путина.
В 2005 году генеральная прокуратура смогла добиться выдачи из швейцарской тюрьмы бывшего руководителя Минатома Евгения Адамова, помешав таким образом его передаче американскому правосудию и потенциальному разглашению российских ядерных секретов. В то же время западные государства неоднократно отказывались экстрадировать в Россию участников громких уголовных дел — Бориса Березовского (Великобритания в сентябре 2003 года и Латвия в феврале и сентябре 2005 года), Владимира Гусинского (Испания в апреле 2001 года и Греция в октябре 2003 года), совладельцев ЮКОСа (Израиль и Великобритания), высокопоставленных представителей Чеченской Республики Ичкерия Ахмеда Закаева (Великобритания) и Ильяса Ахмадова (США).
В 2006 году с подачи Генпрокуратуры Госдума приняла в первом чтении законопроект о восстановлении института конфискации имущества.
2 июня 2006 года президент России Владимир Путин внёс в Совет Федерации представление об освобождении Устинова от занимаемой должности с официальной формулировкой «по собственному желанию».
23 июня 2006 года Владимир Устинов был назначен министром юстиции Российской Федерации (ранее занимавший этот пост Юрий Чайка за несколько дней до этого был назначен генеральным прокурором).
В 2006 году доход чиновника составил 5,5 млн рублей.
14 мая 2008 года был назначен Полномочным представителем Президента Российской Федерации в Южном федеральном округе.
Действительный государственный советник юстиции, заслуженный юрист Российской Федерации. Действительный государственный советник Российской Федерации 1 класса. Окончил Дипломатическую академию МИД РФ.